КапСек

Представьте ситуацию: 🧩 Инсталлировали прибор: установили капиллярную сборку и емкости с буферами, заполнили систему полимером 🧩 Провели пространственную и спектральную калибровки 🧩 Подготовили образцы на электрофорез в формате HID 🧩 Установили плашку в прибор, написали протокол в ПО, начали связывать их и... прибор выдаёт сообщение "Plate Setup Error" #электрофорез

Появление артефактов («dye blobs» или «пятен красителя») в образце аллельного леддера при капиллярном электрофорезе. Симптомы: на электрофореграмме леддера появляются лишние пики, которые не являются аллелями ДНК. Возможная причина: эти пятна являются артефактами, возникающими из-за неполного включения красителя в праймеры при синтезе или при хранении реагентов. ☝️ Для анализа следует использовать только высококачественные аллельные леддеры. Если леддер выглядит «грязным» или имеет низкое качество, его следует заменить. #электрофорез

Спектральная калибровка - это не проверка качества сигнала, а построение матрицы пересчёта между перекрывающимися спектрами красителей. Программа не «узнает» краситель по форме пика на электрофореграмме - она раскладывает суммарный сигнал по заранее заданным эталонным спектрам (Dye Set). Поэтому перед проведением спектральной калибровки необходимо проверить соответствие между матричным стандартом (реагентом) и набором красителей (Dye Set) в соответствии с инструкцией к реагенту. При несоответствии алгоритм программы не сможет адекватно определить красители, даже если сырые данные были идеал…

Иногда при проведении спектральной калибровки картинка сырых данных может обескураживать - то высоты сигналов красителей разные или вообще один или несколько сигналов "уходят" ниже горизонтальной оси (фото 1) ✔️ Если высоты разные, то на идентификации цвета красителя это никак не скажется, но стоит обратить внимание на высоты сигналов красителей в аллельном леддере. ✔️ Если сигнал ушел вниз, то важно дождаться завершения процесса калибровки и оценить коэффициенты качества в таблице. Как правило, сама программа прибора отмечает красным маркером те капилляры, где прошло неудачно. - если сиг…

"Детектор в секвенаторе чёрно-белый. Как он различает цвета красителей?" В капиллярных секвенаторах используют монохромные матрицы - CCD и CMOS. Это не «цветные камеры» в бытовом смысле: они регистрируют не готовую цветную картинку, а интенсивность света в каждой точке сенсора. Принцип работы основан на лазерно-индуцированной флуоресценции. Лазер возбуждает флуоресцентные красители, которыми помечены фрагменты ДНК. Краситель, излучает свет с определённой длиной волны. Оптическая система (призма или дифракционная решётка) разделяет этот смешанный свет на спектральные составляющие, а монохромн…

Но не все неясные сигналы являются следствием нарушения поверхности капилляра. Перед тем как списывать "аномалию" на дефект капилляра, нужно исключить банальные причины - загрязнение реактивов. На фото показано, что во время калибровки вместо одного сигнала оранжевого красителя выявлены множественные сигналы. Было установлено, что используемый формамид ранее был смешан с размерным стандартом и хранился без обозначения этого. ☝️ Любые миксы реагентов обязательно необходимо маркировать на пробирке #калибровка #капсборка

Нарушение внутренней поверхности капилляров невидимо глазом, но выявляется при постановке электрофореза #капсборка

Однако не спешите менять сборку, если отключился один или два капилляра, без которых Вы можете обойтись. Эксперимент показал, что, проводя форез объектов по другим капиллярам, в "пробитом" капилляре тоже происходит обновление пригоревшего полимера на новый. Да, происходит это не быстро, на это может уйти до 10-15 форезов, но тем не менее это возможно. На фото 1-4 последовательно показаны этапы восстановления капилляра. PS: эта капсборка отработала свой положенный срок и даже больше 😊 #секвенатор #электрофорез

На капиллярной сборке пробой тоже отражается - он выводит из строя один или несколько капилляров. Происходит так: ⚡ сперва меченные красителем ПЦР-продукты детектируются (фото 1), еще можно провести несколько форезов, ⚡ а потом в следующей постановке происходит резкое "отключение" капилляра/капилляров - сигналы с ПЦР-продуктов перестают детектироваться (фото 2), ⚡ вплоть до отсутствия шумового сигнала (фото 3) И тут возникает дилемма "Что же делать?!" особенно если новую сборку недавно поставили в прибор #секвенатор #электрофорез

Если все-таки момент с проверкой пузырей воздуха пропустили и запустили форез, то может быть все обойдётся??! Увы, нет. На комплектующих прибора это скажется в виде нагара или оплавления в месте соприкосновения воздуха с поверхностью. Воздействие электрического пробоя нарушает целостность поверхности, образуются микротрещины, приводящие к сокращению срока эксплуатации деталей. #секвенатор